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Herstellen der Instrumente und Lösungen

Zum Entfernen der Eihüllen sowie zum Fassen kleinerer Keimteile sind Pinzetten mit sehr scharfen Spitzen nötig. Gekaufte Pinzetten sind nicht fein genug und müssen daher nachgeschliffen werden. Als Schleifstein gut geeignet ist der Degussit-Stein (mittel), mit dem man trocken schleift. Das Schleifen erfolgt stets unter Binokularkontrolle. Man sucht auf dem Schleifstein eine Stelle aus, die schon abgerieben ist und Reste von Metallstaub aufweist. Beim Schleifen werden beide Backen der Pinzette so fest zusammengedrückt, daß die Spitzen genau aufeinander passen. Je spitzer die Enden werden, um so langsamer und mit geringerem Andruck soll die Pinzette über den Schleifstein geführt werden. Beachten: Auch die Außenseite jeder Backe muß heruntergeschliffen werden, damit feine Spitzen entstehen. Von Zeit zu Zeit den Metallstaub von der Pinzette an einem Kleenex-Tuch abstreifen und die Spitzen kontrollieren. Nach Beendigung der Schleifarbeit werden die Pinzetten in einem Becherglas mit Aqua dest. ausgekocht. Um Siedeverzug zu vermeiden, werden vorher Glassplitter in das Becherglas gegeben. Eine dicke Kleenex-Lage am Boden des Becherglases schützt die empfindlichen Pinzettenspitzen vor Beschädigung.

Modifizierte Spemann-Pipette

Die Spemann-Pipette (Abb. 1.1) wird zum Ansaugen und Umsetzen von Keimteilen und Keimen ohne Vitellinmembran benutzt.

**Abbildung 1.1:** Spemann-Pipette
30mm $\includegraphics [width=15mm]{spette}$

Pasteurpipette oder Glasrohr (etwa 15 cm lang) in der Flamme unter ständigem Drehen erhitzen, bis das Glas weich ist. Außerhalb der Flamme zu einer großen Kapillare von etwa 2 mm Öffnungsdurchmesser ausziehen. Nach dem Erkalten wird der dünnere Teil, jeweils 3 cm von den Verjüngungsstellen entfernt, angesägt (Ampullensäge oder Dreikantfeile) und abgebrochen. Dadurch erhält man zwei Pipettenspitzen. Eine davon wird an der Verjüngungsstelle nochmals erhitzt und die Spitze um 45-60 Grad gebogen. Die andere wird für den Wachslochstanzer (siehe S.

) aufgehoben! Nun beide Enden rund schmelzen (Vorsicht, daß das dünne Ende nicht zuschmilzt!). Auf das dicke Ende ein 5 cm langes Schlauchstück setzen, dessen Ende mit einem Gummistopfen verschlossen wird. Die Druckregulierung erfolgt mit dem Schlauchteil.

Weithalspipette

Die Weithalspipette dient zum schnellen Sortieren von Amphibieneiern und zu deren Transport, solange sie von der Vitellinmembran umschlossen sind. Von einem Glasrohr (ca. 6 mm $\oslash$ ) ein 5 bis 10 cm langes Stück abschneiden. Beide Enden in der Bunsenbrennerflamme rund schmelzen. Oder von einer Pasteurpipette die Verjüngung abschneiden. Nach Erkalten an einem Ende ein passendes Schlauchstück (etwa 5 cm lang) aufsetzen und das offene Ende mit einem Gummistopfen verschließen.

Glas- und Kugelnadeln

Alle Operationen am Keim werden mit Glasnadeln ausgeführt. Diese lassen sich auf zwei Wegen herstellen: Mit der Elektrodenziehmaschine: Aus 7,5 cm langen Hartglasrohrstücken werden zwei Elektrodennadeln gezogen, deren Spitzen nicht, wie bei Elektroden sonst üblich, abgebrochen werden. Eine Nadel wird an der Verjüngungsstelle erhitzt (Sparflamme des Bunsenbrenners), und um 60 Grad gebogen. Dazu hält man die Spitze schräg nach oben (Abb. 1.2).

100mm

**Abbildung 1.2:** Abwinkeln der Glasnadel
$\includegraphics [width=40mm]{nadelbi.eps}$

**Abbildung 1.3:** Die Bunsenbrennertechnik
$\includegraphics [width=40mm]{bunsen.eps}$

Nach dem Erwärmen neigt sie sich durch ihr Gewicht nach unten. Die zweite Nadel wird mit der Spitze kurz in die Flamme gehalten, so daß eine Kugel am Ende entsteht (Kugelnadel). Zur Aufbewahrung steckt man die Nadeln mit dem Schaft aufrecht in ein Plastilinstückchen, das als Nadelhalter dient. Zum Schutz der Glasnadeln und der Hände ein Becherglas o.ä. überstülpen. Mit dem Bunsenbrenner: Dünne Glasstäbe oder -rohre werden in der Flamme erhitzt und außerhalb schnell zu feinen Glasfäden auseinander gezogen. Man bricht jeweils 3 cm von der Verjüngungsstelle entfernt den Glasfaden ab. Dann bringt man die Enden beider Glasfäden unter stumpfem Winkel in die Sparflamme des Bunsenbrenners und schmilzt sie zu einer Kugel zusammen (Abb. 1.3). Rasch aus der Flamme nehmen und horizontal schnell auseinanderziehen! Die spitzere Glasnadel wird als Stichnadel benutzt, die gröbere zur Kugelnadel geschmolzen.

Saugpipetten

Saugpipetten werden benutzt, um überschüssiges Gewebe bei und nach Operationen zu entfernen. Außerdem kann man mit ihnen frische Wundränder herstellen, die besser verheilen als solche, die vor dem Zusammenpressen der Wunde bereits begonnen haben sich abzurollen. Den Umgang mit der Saugpipette muß geübt werden, da ungenügende Kontrolle der Saugkraft nicht selten zum Totalverlust des Keimes führt. Man prüfe auch immer durch Testsaugen, ob nicht die Spitze verstopft ist. Löst sich der Pfropfen plötzlich, entsteht ein starker Saugstrom, der nicht kontrolliert ist. Saugpipetten werden hergestellt, indem von einer Glasnadel die Spitze mit einer Pinzette abgebrochen wird. Das gelingt nur unter dem Binokular. An das andere Ende der Glasnadel wird ein Mundsaugschlauch angesteckt. Aus hygienischen Gründen ist es zweckmäßig, die Mundsaugschläuche zu kennzeichnen und nach dem Gebrauch mit klarem Wasser zu spülen.

Wachslochstanzer

Mit dem Wachslochstanzer (Abb. 1.4) werden Vertiefungen in die Wachsschalen gedrückt, in denen der Keim festgelegt werden kann.

**Abbildung 1.4:** Wachslochstanzer
30mm $\includegraphics [width=30mm]{stanzer.eps}$

Die zweite Pipettenspitze von der Pipettenherstellung am dünnen Ende zu einer geschlossenen Kugel von etwa 2 mm Durchmesser zuschmelzen. Zuvor, falls nötig, die Spitzen noch etwas ausziehen. Die Kugel darf nicht an zu dünnem Stiel sitzen, da sie sonst leicht abbricht. Am besten soll der Stiel etwa dem Kugeldurchmesser entsprechen. Mit der Kugel werden Gruben in das Wachs gestanzt, die die Keime aufnehmen.

Wachsschalen

In Wachsschalen werden Keime und Insekteneier festgehalten, so daß an ihnen manipuliert werden kann. Das Mischungsverhältnis von Bienenwachs und Paraffin ist für den Erfolg der Operation entscheidend. Ist das Material in kaltem Zustand zu spröde, werden die Keime durch kleine Splitter verletzt. Ist es zu weich, haften die Keime an dem Wachs und lassen sich praktisch nicht mehr aus der Operationsgrube entfernen. Deshalb ist bei der Herstellung sorgfältig vorzugehen. Gleiche Gewichtsteile von gelbem Bienenwachs und Weichparaffin (Schmelztemperatur 42 $\ensuremath{^\circ}$ C) werden in Petrischalen (9 cm $\oslash$ ) gegeben und bei 70 $\ensuremath{^\circ}$ C im Brutschrank aufbewahrt, wodurch die Wachsmischung stets flüssig bleibt. Im flüssigen Wachs sinken Verunreinigungen, z.B. Schalenreste von Insekteneiern, nach unten und die Oberfläche der Wachsschale ist immer glatt. Vor Gebrauch wird die Wachsschale aus dem Wärmeschrank genommen und nach Abkühlen an der Luft (Glasschale bricht sonst) in die Wasserkühlung gestellt, bis das Wachs hart ist. Danach wird das Wachs z. B. mit MH-Lösung überschichtet. Nach Gebrauch ist die Flüssigkeit abzuschütten, mit Aqua dest. mehrfach nachzuspülen, damit sich keine Salze anreichern, mit Kleenex abzutrocknen und in den Brutschrank (70 $\ensuremath{^\circ}$ C) zurückzustellen. An Stelle von Glasschalen werden auch Petrischalen aus Kunststoff benutzt, die bei höheren Temperaturen ebenfalls schmelzen. Deshalb muß die Temperatur des Wärmeschranks überwacht werden. Es sind zwei Wachsschalen anzufertigen: Eine für die Experimente mit den Amphibienkeimen, eine zweite für die Präparation der Insekteneier.

Physiologische Kochsalzlösungen

Modifizierte Holtfreter-Lösung (MH-Lösung)

Diese Lösung wird zur Aufzucht von Amphibienkeimen benutzt, denen die Vitellinmembran entfernt wurde. Für die modifizierte Holtfreter-Lösung werden drei Stammlösungen unsteril angesetzt, die im Kühlschrank aufbewahrt werden:

Rezeptur für die Modifizierte Holtfreter-Lösung
Ansatz der Stammlösungen			Gebrauchsfertige Lösung
Stammlösung I			36,4	ml
23,5	g	NaCl
227,5	ml	A. d.
Stammlösung II			10,0	ml
2,65	g	CaCl $_{2}$
199,0	ml	A.d.
Stammlösung III			5,0	ml
2,0	g	KCL
198,0	ml	A. d.
1-3			950,0	ml	Aqua dest.
			MH-Gebrauchslösung

Sterilisation: Die Gebrauchslösung wird in eine Flasche gefüllt und diese mit einer Drehkappe fest verschlossen. Die Flasche wird in einen Dampfdrucktopf gestellt, worin sich ein Einsatz und ca. 1/3 l Aqua dest. befinden. Anschließend wird der Deckel aufgesetzt (Gummiring im Innenrand auf richtigen Sitz prüfen!). Den Kocher auf Stufe 3 schalten und, nachdem reichlich Dampf ausgetreten ist, den roten Schieber am Deckelgriff auf II schieben. Wenn der 2. rote Ring am Druckventil sichtbar wird, den Kocher auf Stufe 1 $\frac{1}{2}$ zurückschalten und die Lösung 30 Minuten sterilisieren. (Der 2. Ring bleibt dann gerade immer sichtbar.) Dann den Topf auf eine geeignete Unterlage stellen und erkalten lassen.

Auf keinen Fall den Deckel vor dem Erkalten öffnen ! Explosionsgefahr !

Der erkalteten Lösung werden 2,5 ml Bactrim $\ensuremath{^\copyright}$ - Lösung mit einer sterilen Spritze zugesetzt. Die Lösung wird im Kühlschrank aufbewahrt. Die verdünnten MH-Lösungen sollten als sterile Lösungen im Kühlschrank vorrätig sein.

Locke-Lösung

Die Locke-Lösung wird zur Lebendbeobachtung von Hühnerembryonen gebraucht.

9,00	g	NaCl
0,40	g	KCl
0,24	g	CaCl2
0,20	g	NaHCO3
		in 1l Aqua dest. lösen.

Sterilisieren und erkalten lassen. Pro 1l Lösung 2,5 ml Bactrim zusetzen.

Niu Twitty-Lösung

Operations- und Aufzuchtslösung für Amphibienkeime, wird benutzt für die HRP-Markierung retinaler Nervenfasern.

Vorratslösungen, *getrennt* im Kühlschrank aufbewahren.
Lösung A		Lösung B		Lösung C
68 g	NaCl	0,4 g	KH $_{2}$ PO $_{4}$	4 g	NaHCO $_{3}$
1 g	KCl	2,2 g	Na $_{2}$ HPO $_{4}$
1,6 g	Ca(NO $_{3}$ ) $_{2}$ *4 H $_{2}$ O
2 g	MgSO $_{4}$
+ 1000 ml	Aqua dest.	+ 500 ml	Aqua dest.	+ 500 ml	Aqua dest.

Gebrauchslösung, im Kühlschrank aufbewahren.
Lösung A	Lösung B	Lösung C
50 ml	25 ml	25 ml
+ 450 ml	+ 225 ml	+ 225 ml	Aqua dest.
ergibt 1000 ml Gebrauchslösung

Sterilisieren von Instrumenten

Die empfindlichen Keime müssen vor Bakterien- bzw. Pilzbefall geschützt werden. Es ist wichtig, möglichst keimarm zu arbeiten.

a) Glasschalen und -pipetten

(ohne Gummiteile!) werden in einen kalten Brutschrank gelegt, der dann auf 200 $\ensuremath{^\circ}$ C hochgeheizt wird. Schalen ohne Deckel und Pipetten werden vorher mit Alufolie umhüllt. Nach 2 Std. wird der Brutschrank abgeschaltet. Langsam auskühlen lassen ! Glasschalen und Geräte erst vor Gebrauch öffnen oder aus der Folie wickeln!

b) Glasinstrumente, Pipetten und Pinzetten

10 Minuten lang in Aqua dest. auskochen und sofort benutzen.

Wasserkühlung

Die Wachstumsgeschwindigkeit der Keime ist temperaturabhängig, deshalb werden die Petrischälchen mit den Keimen im Wasserbad gekühlt. Um zu verhindern, daß Wasser zwischen Boden und Deckel des Schälchens dringt und durch Kapillarkräfte ins Innere des Schälchens gesaugt wird, wird der Deckel verkehrt herum aufgesetzt (Abb.

**Abbildung:** Glasschälchen in der Wasserkühlung
$\includegraphics[width=60mm]{schale.eps}$

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Hans-Peter Rangol