Unterabschnitte

• Versuche mit der Neuralleiste
• Versuche zur Herzentwicklung
• Versuche mit der Augenanlage
• Versuche zur Entwicklung der optischen Projektion

Protokollversuche

Versuche mit der Neuralleiste

Die Neuralleiste ist eine ,wulstförmige`Erhebung der Neurula, die die Medullarplatte begrenzt. Aus ihr wandern Zellen aus, die sowohl die Pigmentzellen der Haut als auch den Knorpel des Visceralskelettes bilden. Da Xenopus kaum eine Pigmentierung besitzt, sollen Einflüsse von partieller oder totaler Neuralleistenentfernung auf die Knorpelbildung des Visceralskelettes studiert werden. Dabei ist zu prüfen, ob es zu teilweisen oder totalen Ausfällen kommt, und ob diese Ausfälle auf das Gebiet der entfernten Neuralleisten beschränkt bleiben. Aufgaben:

1. im vorderen Bereich,
2. im hinteren Bereich,
3. total.

Die Operation kann zu zwei verschiedenen Zeitpunkten erfolgen: in der frühen Neurula (St. 12 + 13), wenn die Neuralleisten gerade schwach erkennbar sind oder in mittleren bis späten Neurulastadien (St. 14 + 15). Ein- und beidseitige Herausnahme der Neuralleiste (Abb. 5.2):

Abbildung 5.2: Entfernung der Neuralleistenzellen

30mm

Bei der Exstirpation ist darauf zu achten, daß nicht nur der aufgewölbte Medullarwulst in voller Breite entfernt wird, sondern auch das tiefer liegende Zellmaterial der äußeren Keimschicht herausgeschnitten wird. Die Keime werden bis zur Junglarve (ca. St. 45) aufgezogen und dann in 10% Formol 1 Tag lang fixiert. Danach zieht man den Larven mit zwei spitzen Pinzetten vorsichtig die äußere Haut ab, um eine bessere Färbbarkeit des Visceralskelettes zu erreichen. Färbung: Toluidinblau (s. Seite ). Fragestellung: Vergleiche die Ausbildung des Visceralskeletts in den operierten Tieren in qualitativer und quantitativer Hinsicht. Benutze als Vergleichsstandard nicht manipulierte Larven dieser Entwicklungsstufe.

Versuche zur Herzentwicklung

Das unpaare Herz der Wirbeltiere entsteht aus paarigen Mesodermfalten, die sich anterior und ventrad relativ zur Neuralanlage vereinigen (Abb. 5.3).

Abbildung 5.3: Vereinigung des Herz-Mesoderms
Abbildung 5.4: Herzanlage von lateral

Abbildung 5.5: Spaltung der Herzanlage

Aufgaben:

1. Darstellung der Normalentwicklung der Herzanlage.
   Hierzu sollen von Keimen in verschiedenen Neurulastadien (12-20) histologische Querschnitte angefertigt werden. Methoden: Bouin-Fixierung (S. ); Paraplast-Einbettung (S. ); Pikroblauschwarz-Färbung (S. ). Die gefärbten Schnitte sollen zur Auswertung gezeichnet und/oder fotografiert werden.
2. Isolierung der linken oder rechten Herzanlage aus einer frühen oder mittleren Neurula.
   Das in der Abb. 5.4 gekennzeichnete Feld wird mit Glas- und Kugelnadel tief umschnitten und herausgehoben. Unter dem Ektoderm muß am Isolat die dicke braunrote Mesodermschicht noch anhängen. Der Restkeim muß ebenfalls aufgezogen werden. Fragestellungen:
   1. Bildet das Isolat Herzstrukturen aus?
   2. Wenn ja, welche Abschnitte?
   3. Wie verhält sich der Restkeim?
3. Spaltung der Herzanlage.
   Aus einer späten Neurula mit geschlossenem Neuralrohr wird vom vordersten Abschnitt ein linkes oder rechtes Neuralleistenstück entfernt. In eine frühe Neurula wird ventral und medial zur Neuralanlage ein tiefer Schnitt gemacht und das Neuralleistenstück implantiert (Abb. , 5.5 2) und 3)). Bis zum Festwachsen mit Wachslasche oder Deckglassplitter in dieser Position halten. Fragestellungen:
   1. sind alle Herzabschnitte vorhanden?
   2. ist die Schlagfrequenz von Kontroll- und Doppelherzen gleich?
   3. In welcher Form ist bei Larven mit Doppelherzen das Arteriensystem (Arterienbogen) ausgebildet? Zur besseren Darstellung des Blutgefäßsystems wird hierzu bei Larven ab dem Stadium 45 die Co-DAB-Reaktion (S.15) zum Nachweis von Peroxidasen durchgeführt.

Versuche mit der Augenanlage

Die Augenblasen der Wirbeltiere entstehen durch Ausstülpungen des Neuroepitheliums im Bereich des Diencephalon. Während der folgenden Invagination zum Augenbecher induziert das Neuroepithel in der überlagernden Epidermis Cornea und Linse. Anschließend erfolgt die Abschnürung des Linsenbläschens und die Differenzierung der einzelnen Retinaschichten. Aufgaben:

1. Normalentwicklung des Auges.
   Anhand von histologischen Querschnitten zu verschiedenen Entwicklungsstadien (18-33/34) soll die Normogenese des Xenopus-Auges nachvollzogen und beschrieben werden. Methoden: Bouin-Fixierung (S. ); Paraplast-Einbettung (S. ); Hämatoxylin-Eosin-Färbung (S. ).
2. Verkleinerung der Augenanlage auf die Hälfte oder ein Viertel.
   Die Anlage von Keimen ab Stadium 24 wird zunächst mit Hilfe von Glas- und Kugelnadel halbiert und eine Hälfte mit einer Saugpipette (siehe ) abgesaugt. Falls ein Viertelauge hergestellt werden soll, wird dieser Vorgang mit der verbliebenen Hälfte wiederholt. Fragestellungen:
   1. Wie entwickelt sich das Augenfragment während der folgenden Tage?
   2. Wie verhält sich die Größe des operierten Auges in späten Larvenstadien zum gegenüberliegenden Kontrollauge?
   3. Ist eine Linse ausgebildet? Und wenn ja, wie groß ist sie im Verhältnis zum Augenbecher? (Linsen-Augenbecher-Index, siehe LAI-Formel, LAI )
3. Verpflanzung einer ganzen oder halbierten Augenanlage in die Rumpfseitenwand eines Embryos.
   Zwei gleichaltrige Embryonen (Stadium 26/27) aussuchen und in benachbarte Wachsgruben einspannen. Beim Spenderembryo die rechte Augenanlage herausschneiden (evtl. halbieren). Beim Wirtsembryo mit einer Glasnadel die rechte Rumpfseitenwand senkrecht zur Körperlängsachse schlitzförmig aufschneiden, ohne das darunterliegende Mesoderm und Endoderm zu verletzen. Mit zwei Kugelnadeln die Epidermis des Wirtes taschenförmig unterminieren und in diese Höhle die Augenanlage einschieben. Bis zur Wundheilung die Epidermisränder mit Wachslaschen fixieren. Fragestellungen:
   1. Wie entwickelt sich die Augenanlage in der fremden Umgebung ?
   2. Gibt es Größenunterschiede bei ganzen oder halben implantierten Augenanlagen?
   3. Wird eine Linse gebildet? Falls ja, wie groß ist sie verglichen mit dem Augenbecher? (LAI-Formel).
   4. Wie ist die Schichtung der Retina bei transplantierten Augen? Ist ein optischer Nerv ausgebildet? Histologische Schnitte anfertigen und auswerten.
   Bemerkungen: Um eine Linseninduktion nachzuweisen, muß am Spenderauge bei der Transplantation die darüberliegende Epidermis entfernt werden! Berechnung des Linsen-Augenbecher-Index (LAI-Formel):
   

   $$LAI = \frac{Linse\left[ mm^{2} \right]}{Augenbecher \left[ mm^{2} \right]}$$ (1)

   
   

Versuche zur Entwicklung der optischen Projektion

Bei Fischen und Amphibien verbinden die Fasern der retinalen Ganglienzellen das Auge mit dem Mittelhirndach, dem Tectum opticum. Die Projektion ist retinotop geordnet, so daß ein genaues Abbild der Retina, und damit des Sehfeldes, gewährleistet ist: Temporale Retinaaxone enden im rostralen Tectum, nasale Axone im caudalen Tectum, ventrale Fasern im medialen Tectum und dorsale Axone im lateralen Tectum. Am Beispiel der Entwicklung der retinotectalen Projektion bei Xenopus sollen Fragen zum axonalen Wachstum, zur Wegfindung von wachsenden Axonen und zur selektiven Verbindung zwischen Neuronen diskutiert werden. Mit HRP-Markierungen sollen zu verschiedenen Entwicklungsstadien (30-50) die retinalen Axone angefärbt werden und so auf ihrem Weg zum Tectum verfolgt werden. Methoden: HRP-Markierungen (S. ); Co-DAB-Histologie S. ) an Schnitt- und Totalpräparaten. Aufgaben:

1. Darstellung der optischen Faserbahn und ihrer Entwicklung.
2. Erstellen einer Raum-Zeit-Tabelle für das Wachstum der retinalen Axone.
3. Beschreibung der Wachstumskegel (growth cones) und der Faserverzweigungen in den verschiedenen Abschnitten der optischen Bahn.
4. Bestimmung von Projektionsgebieten im Diencephalon.