Unterabschnitte

• Toluidinblau
• Hämatoxylin-Eosin
• Pikroblauschwarz
• Färbung mit Boraxkarmin
• HRP-Markierungen retinaler Nervenfasern
• Co-DAB-Methode

Färbemethoden

Toluidinblau

(zur Darstellung des Visceralskelettes, Protokollversuch Neuralleiste)

• Fixierte Embryonen einen Tag in 70 % -igem Alkohol (+10 Tropfen Ammoniak auf 250ml Alkohol).
• Zwei Tage in Toluidinblau (0,5g auf 100 ml A.dest.).
• Differenzierung in 70 % -igem Alkohol + 0,05 % Salzsäure (100 Teile 70% Alkohol, 2 Teile 0,05% Salzsäure) bis der Schwanz der Larven gerade entfärbt ist. (Binokularkontrolle).
• Einen Tag stoppen der Differenzierung in 95 % -igem Alkohol.
• Je einen Tag in Isopropylalkohol und Rotihistol.

Hämatoxylin-Eosin

(Übersichtsfärbung zur Augenentwicklung)

• Rotihistol I-III je 3-5 min
• 100% Alkohol I 5 min
• 100% Alkohol II 5 min
• 96%, 80% und 70% Alkohol je 3 min
• 2 x Aqua dest. je 3 min
• Hämatoxylinlösung 0,1% 5 min
• HCl-Alkohol 1 min
• Leitungswasser 20 min
• Aqua dest. kurz eintauchen
• Eosin (+1 Tropfen Eisessig/50 ml) 1 min
• 2x Aqua dest. je 1 min
• 70% , 80% , 96%, 100% (2x) Alkohol je 3 min
• Rotihistol I u. II je 3-5 min
• Eindecken mit Eukitt

Pikroblauschwarz

(Übersichtsfärbung zur Herzentwicklung)

• Rotihistol I-III je 3-5 min
• 100% Alkohol I 5 min
• 100% Alkohol II 5 min
• 96% , 80% und 70% Alkohol je 3 min
• Aqua dest. 2 min
• Kernechtrot-Aluminium-Sulfat 5-10 min
• Spülen in Aqua dest. unter Mikroskopkontrolle
• Blauschwarz (progressive Färbung, d.h. Mikroskopkontrolle!!)
• Aqua dest. 2 min
• 70% , 80% , 96% u. 100% (2x) Alkohol je 3 min
• Rotihistol I u. II je 3-5 min
• Eindecken mit Eukitt

Färbung mit Boraxkarmin

• Die Keime werden über die aufsteigende bzw. absteigende (bei Rotihistolaufbewahrung) Alkoholreihe bis in 70% Ethanol überführt.
• Färbung in Boraxkarmin für 24-36 Std.
• Differenzierung in 70% Ethanol + 25% HCl (20:1) für etwa 18 Std.
• Stoppen der Differenzierung in reinem 70% Ethanol.
• Danach aufsteigende Alkoholreihe bis Rotihistol.

Sind die Präparate auf einem Objektträger aufgeklebt, wird dieser auf den Boden einer Petrischale gelegt und mit den verschiedenen Lösungen überschichtet.

HRP-Markierungen retinaler Nervenfasern

Horseradish Peroxidase (HRP) ist ein retro- und anterograder neuronaler Tracer, der zur Markierung der Fasern des optischen Nerven benutzt werden soll.

1. Vorbereitung:
   Xenopus-Larven der Stadien 45/46 werden in Niu Twitty/MS überführt und dort zur Betäubung 5 - 15 Minuten gelassen. Nicht länger, da die Larven sonst sterben könnten! In der Zwischenzeit wird ein kleines Petrischälchen mit Kleenex-Papier ausgelegt (Falten sind erwünscht) und mit Niu Twitty-Lsg. gefüllt. In 4 Tropfen des Tensids NonIdet wird soviel des kristallinen HRP's gelöst wie nur irgend möglich ist. Die Lösung muß nicht homogen sein. Die Larve wird mit einem Löffel in die Petrischale überführt und so in eine Falte gelegt, daß am Auge operiert werden kann.
2. Durchführung:
   Mit ca. 4-facher Vergrößerung wird unter dem Binokular mit Glasnadeln die Epidermis über dem Auge entfernt. Mit den zugeschliffenen Operationspinzetten wird die Linse gefaßt und aus dem Augenbecher exstirpiert. Mit einer Kugelnadel werden aus der NonIdet/HRP-Lsg. besonders stark gesättigte Tröpfchen (dunkelbraun) aufgenommen und in den offenen Augenbecher gebracht. Hierbei ist darauf zu achten, daß möglichst kein Gewebe außerhalb des Augenbechers benetzt wird. Wenn dies gelungen ist, wird der Augenbecher mit dem Gewebekleber Histoacryl verschlossen. Hierzu wird eine Glasnadel an der Spitze abgebrochen und so eine Kapillare hergestellt, die auf den Mund-Saugschlauch gesteckt wird. Aus der Vorratsampulle mit Histoacryl wird ganz wenig in die Kapillare eingesogen.
   Vorsicht ! Unfallgefahr !
   Zum Verkleben des Augenbechers bewegt man die Kapillare in die Nähe des Larvenauges und tupft nur ganz wenig auf die Öffnung. Die Pipette sofort wegziehen! Ist der Verschluß geglückt, wird die Larve in frische Niu Twitty-Lösung überführt; hier soll sie wenigstens 30 min überleben, damit der Tracer bis in das Tectum vordringen kann. Anschließend wird die operierte Larve mit Glutaraldehyd für eine Stunde fixiert (siehe S. ).
3. Vorbereitung des Präparates zum Nachweis der HRP mit der Co-DAB-Methode:
   Mit Pinzetten wird unter dem Binokular die Epidermis des Kopfes entfernt. Vom Gehirn wird die Pigmenthaut vorsichtig abgezupft. Der Schwanz des Präparates wird nach dem hinteren Rumpfteil abgeschnitten und der Darm vollständig herausgenommen.

Im Totalpräparat wird die HRP mit der Co-DAB-Methode nachgewiesen (Co-DAB).

Co-DAB-Methode

(Cobalt / Diaminobenzidin zum Nachweis von Peroxidasen)

Diaminobenzidin (DAB) ist extrem cancerogen!

Durchführung nur im Histolabor mit Betreuer !

	Totalpräparate	Gefrierschnitte
Spülen in PBS (0,1 m)	3 x je 15 min	3 x je 2 min
Waschen in Tris/HCL	3 x je 2 min	3 x je 1 min
Beizen in CoCl2	13 min	10 min
(1g Kobaltchlorid in 200 ml Tris/HCl)
Waschen in Tris/HCL	2 x je 6 min	2 x je 5 min
Waschen in PBS (0,1 m)	2 x je 6 min	2 x je 5 min
Präinkubation
100 mg DAB in 5 ml Aqua dest. lösen,	8 min	5 min
dann 195 ml PBS zugeben.
Inkubation
Zugabe von 2 - 4 ml 0.3 % H2O2	30 min	25 min
Waschen in PBS (0,1 m)	3 x je 15 min	3 x je 10 min
Terpineol I und II	je 2 min
Rotihistol I und II	je 5 min
	in Rotihistol aufbewahren	Eindecken

$\parbox{12cm}{{\bf DAB wird durch Hypochlorit-L\uml {o}sung (z.B. Da... ...utzt werden, werden nach Gebrauch mit dieser L\uml {o}sung gesp\uml {u}lt!}}$